Krátce po událostech prvního dílu dojde v New Yorku k sérii loupežných přepadení vedených superpadouch Electrem. Ten se tentokrát snaží získat všechny součásti k sestavení zařízení Bio-Nexus, které mu umožní zesílit jeho schopnosti a jeho nadpřirozenou sílu pro ovládnutí celé Země a samotné galaxie.

Podobně jako předchozím díle, i zde hráč se Spider-Manem šplhá po budovách, zachraňujte rukojmí, zneškodňujte bomby, vyhýbá se skrytým pastem a bojuje se zločinci. Novinkou je řada nových technik a vylepšení, včetně elektrických pavučin, ledových pavučin, taserů a elektrického brnění. Splněním určitých herních cílů lze Spider-Manovi také odemknout nové kostýmy, kde některé z nich mají i speciální schopnosti. Nechybí ani sbírání skrytých komiksů, které pak v menu hry odemykají bonusy v podobě obrazové galerie.